Родился в подмосковном селе Пехорке и с юных лет стремился к иночеству. По воле родителей вступил в брак, принял сан священства, но через год овдовел и принял пострижение в Дубенском Успенском монастыре. За добродетельную жизнь был избран игуменом обители и так много потрудился для нее, что впоследствии она стала называться его именем — Серапионовой пустынью.

Желая предаться более строгим подвигам, святой слагает с себя настоятельство и переходит в Троице-Сергиеву лавру, в которой в 1495 г. становится игуменом. Святой пользовался большим уважением великого князя Иоанна Васильевича, и известно, что по его ходатайству он помиловал троих осужденных на смертную казнь боярынь.

Присутствуя на Соборе (1504 г.), святитель горячо отстаивал церковные и монастырские имения, как средство благотворительности.

В 1506 г. хиротонисан в архиепископа Новгородского. Во время большого пожара в Новгороде, в 1508 г., святитель своими слезными молитвами умолил Господа о его прекращении.

Много бед перенес святитель Серапион: в 1509 г. он был лишен кафедры и сослан в Московский Андроников монастырь. В 1511 г. св. Серапион переселяется в Троице-Сергиеву лавру, где в непрестанном подвиге богомыслия и молитвы проводит последние годы жизни, сподобившись от Господа дара прозорливости и чудотворения.

Приняв схиму, святитель мирно скончался 16 марта 1516 г. Нетленные мощи его были обретены 7 апреля 1517 г. и доныне почивают под спудом в Серапионовой палате, у Троицкого собора, в Троице-Сергиевой лавре.

Господь прославил Своего угодника даром чудотворения как при жизни, так и по смерти: однажды в праздник Успения святитель исцелил хромого, который много лет ползал на ногах и руках, опираясь на деревяшки.

В 1608 г., во время осады лавры поляками, многие иноки и миряне видели его в святительском облачении, пришедшего в храм помолиться о своей обители.